【学术前沿】胡德庆/高欣联合团队揭示HIV潜伏感染与复制的表观遗传与转录调

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【学术前沿】胡德庆/高欣联合团队揭示HIV潜伏感染与复制的表观遗传与转录调

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艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染所引起的对人类健康具有极大危害的传染病。根据中国CDC的数据统计,艾滋病的新发病例数和死亡人数均呈逐年上升趋势,截至2018年底,中国存活艾滋病感染者约125万人。HIV包括HIV-1 和HIV-2两种类型,其中HIV-1是导致AIDS的主要病原。HIV通过性接触、血液、母婴垂直感染等方式感染人体内的CD4+ T淋巴细胞,损害机体的免疫系统,从而引起各种致死性的机会性感染或恶性肿瘤发生。自1983年法国Françoise Barré-Sinoussi和Luc Montagnier发现分离HIV病毒以来,人类在过去30多年中对HIV的致病机理和ADIS防治方法上取得了巨大的进步,特别是1996年美籍华裔科学家何大一提出的高效抗逆转录病毒(highly active antiretroviral therapy, HAART)疗法使曾经致命的AIDS成为大部分患者可以长期生存的慢性病。然而,在靶细胞中潜伏的HIV-1前病毒处于转录抑制状态,可以逃避宿主免疫系统和HAART的攻击。当停止HAART治疗后,前病毒会发生迅速的基因转录激活和复制,导致患者体内出现大量病毒颗粒并产生AIDS临床症状【1】。因此,HIV-1的潜伏感染是治愈AIDS疾病的最主要障碍。深入研究HIV潜伏感染和复制的分子机制能够揭示新的抗AIDS药物设计靶点并有望根除患者体内潜伏感染的HIV病毒以实现AIDS的彻底治愈。
HIV属于逆转录病毒科,其基因组由两条相同的单正链RNA组成,病毒颗粒内含有逆转录酶(reverse transcriptase, RT)和整合酶(integrase, IN)。在RT的催化下,病毒基因组RNA转变为dsDNA,随后在IN和宿主细胞辅因子LEDGF/p75的协助下,dsDNA选择性地整合至转录活跃的宿主染色质区域,形成前病毒并进入转录沉默的潜伏状态。前病毒基因转录由长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)所驱动,其活性受到病毒自身蛋白、宿主转录因子、染色质修饰和结构变化以及RNA聚合酶II转录暂停与释放等多种因素的调控【1】。LEDGF/p75是含有PWWP结构域的染色质修饰结合蛋白,除了通过结合IN调控HIV在宿主基因组上的选择性整合外,LEDGF/p75还可以作为细胞内多个蛋白质复合体的结合因子,参与调控多种生物学过程,包括染色质修饰、基因转录、选择性剪接等【2-4】。HIV前病毒会劫持宿主细胞内的表观遗传与转录调控机制来激活或沉默病毒基因转录,从而维持自己的潜伏和复制。鉴于LEDGF/p75在调控宿主细胞基因转录中的重要作用,其除了调控HIV选择性整合外,是否影响整合后前病毒在宿主细胞内的复制命运?
2020年5月15日,天津医科大学/实验血液学国家重点实验室的胡德庆课题组与高欣博士合作在Science Advances在线发表了题为“Competition between PAF1 and MLL1/COMPASS confers the opposing function of LEDGF/p75 in HIV latency and proviral reactivation”的研究论文(第一作者为2018级博士研究生高茹),报道了 LEDGF/p75在HIV前病毒潜伏感染与复制激活中对病毒基因转录调控具有截然相反的功能,并揭示其分别依赖于PAF1与MLL1/COMPASS复合体在转录延伸和染色质修饰层面发挥功能的作用机制,为HIV潜伏感染与复制的表观遗传与转录调控机制提供了新的认识,并为清除宿主细胞内潜伏感染的前病毒提供了潜在的药物干预靶点。

【学术前沿】胡德庆/高欣联合团队揭示HIV潜伏感染与复制的表观遗传与转录调

在这项研究中,作者首先利用两种HIV潜伏感染的细胞模型发现缺失LEDGF/p75后,处于潜伏状态的前病毒基因出现了自发的转录激活。而当作者诱导宿主细胞内前病毒复制时,敲低LEDGF/p75表达却抑制了病毒基因的转录激活,提示LEDGF/p75在前病毒潜伏维持和复制中具有抑制和激活病毒基因转录的功能。降低LEDGF/p75的表达,处于活跃转录状态的病毒基因不能有效地恢复到转录抑制状态,说明LEDGF/p75在建立前病毒潜伏状态中也发挥重要功能。那么LEDGF/p75是利用什么机制来抑制潜伏状态前病毒的基因转录呢?作者利用了亲和纯化和定量质谱(multidimensional protein identification technology,MudPIT)的方法与功能实验手段,发现PAF1复合体可以与LEDGF/p75结合并在HIV前病毒潜伏感染的建立和维持中发挥重要功能。但是,缺失PAF1复合体并不影响前病毒复制过程中病毒基因的转录激活。
为了揭示LEDGF/p75与PAF1在潜伏状态时抑制前病毒基因转录的作用机制,作者分别利用了HIV-LTR和Gal4 UAS-HIV-LTR两套荧光报告系统,发现LEDGF/p75与PAF1以相互依赖的方式直接抑制HIV LTR的转录活性,其中PAF1对LTR的转录抑制功能需要LEDGF/p75对其在LTR上的招募。哺乳动物的PAF1复合体最早由中国科学院生物物理所朱冰研究员在Danny Reinberg实验室进行博士后研究期间分离鉴定【5】。早期的研究认为其功能是通过与RNA聚合酶II结合促进基因的转录延伸。近年的研究发现PAF1复合体不仅可以促进基因转录延伸,而且在基因启动子下游RNA聚合酶II转录暂停的建立、转录终止、mRNA poly(A)加尾以及选择性剪接等过程发挥功能 【6】。潜伏状态HIV前病毒LTR的一个最明显的特征是RNA聚合酶II的转录暂停(RNA Pol II pausing),作者发现敲低PAF1和LEDGF/p75的表达可以释放LTR上处于转录暂停的RNA聚合酶II,说明LEDGF/p75是通过PAF1在前病毒LTR上建立RNA聚合酶II的转录暂停来抑制病毒基因转录,从而建立和维持前病毒的潜伏感染。
为了研究LEDGF/p75在复制时对前病毒基因转录的激活机制,作者检测了LTR上的染色质修饰变化情况,发现H3K4me3水平在前病毒复制时急剧上升,提示H3K4甲基转移酶可能参与调控了复制时前病毒基因的转录激活。论文通讯作者在Ali Shilatifard实验室学习期间,专注于组蛋白H3K4甲基化修饰建立的生化机制研究,系统揭示了COMPASS复合体成员在建立染色质不同区域H3K4甲基化修饰中的作用【7-9】。随即作者分别检测了COMPASS家族成员在复制中对前病毒基因转录的调控作用,发现MLL1/COMPASS复合体是建立和维持病毒基因转录激活所必需。以往的研究发现,LEDGF/p75是MLL1/COMPASS复合体的结合蛋白,可以招募染色体异位所形成的MLL1融合蛋白至与造血干细胞自我更新调控相关的基因上,导致其异常转录激活,从而促使白血病的发生【3,10】。作者发现LEDGF/75在MLL1/COMPASS复合体结合至LTR及其在病毒基因转录激活中发挥重要作用,说明HIV前病毒复制和MLL1异位蛋白采用类似的表观机制促进了疾病的发生与进展。
蛋白质截断体相互作用的实验发现PAF1和MLL1结合在LEDGF/p75的IBD (integrase binding domain) 结构域上,并揭示它们与LEDGF/p75的相互作用是相互排斥的。作者发现在前病毒复制过程中,MLL1与LEDGF/p75和LTR的结合增加,而PAF1与LEDGF/p75和LTR结合减少。那么是什么机制使LEDGF/p75在HIV潜伏感染状态下与PAF1的结合转变为复制时与MLL1结合呢?结构生物学的研究发现,MLL1通过IBM (IBD biding motif)基序以磷酸化修饰依赖的方式与LEDGF/p75结合(11)。作者随即分析了MLL1 磷酸化修饰的质谱数据,发现IBM区域的S136,S142和S153位点在体内可以被磷酸化修饰。对这三个位点进行定点突变显示其磷酸化修饰在MLL1与PAF1竞争性地结合至LEDGF/p75和LTR中发挥关键作用。
为了寻找前病毒复制时对MLL1进行磷酸化修饰的激酶,作者分析了MLL1相互作用蛋白的质谱数据,并对与MLL1结合的潜在激酶分别进行了敲低,发现激酶CSNK2-A2在IBM的磷酸化修饰以及MLL1与LEDGF/p75和LTR结合中起着重要作用。在潜伏感染的细胞系和原代CD4+T模型中诱导前病毒复制,发现转录因子NF-κB可以上调CSNK2-A2表达。敲低CSNK2-A2表达或干扰其激酶活性可以显著地抑制复制中病毒基因的转录激活。以上结果表明,在前病毒复制过程中,NF-κB介导的CSNK2-A2蛋白表达上调磷酸化修饰IBM基序,使MLL1竞争性地结合至LEDGF/p75并在LTR染色质区域建立H3K4me3;通过释放结合在LTR的PAF1和招募SEC复合体来促使转录暂停的RNA 聚合酶II进行高效转录延伸(productive elongation),从而增强病毒基因的转录。