随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学

hiv核酸检测

变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。简单的说就是病毒感染人体后,一般情况下可通过一系列检测被发现,而最早能被检测到的是病毒核酸。现有的酶联免疫等血清学检测方法检测的是抗原或抗体,而核酸检测技术检测的是病毒核酸,所以能更早地发现病毒感染。HIV核酸检测将艾滋病病毒的检测"窗口期缩短至11天,并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测"窗口期"分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。血液安全由此可得到更好保障。

编辑本段 方法及程序

HIV核酸定性检测

1.1 方法和试剂

1.1.1 方法

(1)检测方法为商品化试剂盒和实验室自建方法,商品化试剂应严格按说明书操作。下面介绍的方法是实验室自建方法,供参考。

(2)检测血浆或血清样品使用逆转录PCR(RT-PCR)方法,建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法;检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。

(3)设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品;阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。

1.1.2 试剂

(1)PCR引物:一般使用扩增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计,应尽量涵盖常见的HIV流行毒株,也可使用兼并性引物。

(2)主要试剂:包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需的试剂。使用商品化核酸提取纯化试剂、逆转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。

(3)抗污染试剂:实验室自建检测方法可使用抗污染试剂,参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。

1.2 扩增目的基因片段

1.2.1 样品的采集和处理

1.2.2 核酸提取

可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存,RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。

1.2.3 逆转录合成cDNA

使用商品化试剂并按说明书操作。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中,在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。

1.2.4 PCR扩增反应

使用商品化试剂按说明书操作。PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶等)、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板(DNA或cDNA)。在扩增仪中,按照设定的程序进行扩增。一般使用二次扩增的套式PCR扩增方法。

1.3 扩增产物分析及结果报告

1.3.1 扩增产物分析

扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法,与分子量标准比较,判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。

1.3.2 结果判定和报告

(1)实验成立的条件:每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照,只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立,可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。

(2)HIV核酸检测阳性:使用商品化检测试剂,发现核酸阳性反应,应该重复采集样品进行复测,复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性,复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果,需进一步随访检测。

(3)HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。

(4)应在完成检测后7个工作日内发出检测报告。

HIV核酸定量检测

2.1 方法

HIV核酸定量检测主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增两种方法。国内常用的方法中,NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1采用国际单位(IU/ml),与NASBA的拷贝数关系基本为1:1;Amplicor Cobas 的拷贝数约为1.2~1.5国际单位;bDNA方法的拷贝数约为0.8~1.0国际单位。不同方法的关系与HIV的亚型有关。

2.2 试剂

必须使用经中国药品生物制品监督管理局注册批准的商品化试剂并严格按说明书操作。

2.2.1 靶核酸扩增试剂和性能

(1)RT-PCR扩增试剂